在使用有些厂家5通道的荧光定量仪时,为了---实验结果的性和准确性都要在实验中使用rox(一种荧光染料)或的reference dye,这些荧光染料都必须单独使用一个检测通道。这样以来,真正能检测多重pcr荧光信号的有效通道只有4个,而且使用校正染料可能会增加后期的使用成本。有的荧光定量pcr的检测通道是只为自已厂家的的荧光染料或试剂开放的,pcr仪,有效检测通道也绝非像宣传资料中宣称的那么多。在购买前确认荧光定量pcr仪器的有效检测通道尤为重要,不能单单只听宣传。
pcr技术的本质是体外---扩增,加热使双链dna解开螺旋,在退火温度条件下引物同模板dna杂交,在taq dna聚合酶,dntps,mg2+和合适ph缓冲液存在条件下延伸引物,重复 “变性***退火***引物延伸”过程至25~40个循环,呈指数级扩大待测样本中的---拷贝数。
普通的pcr仪
一次pcr扩增只能运行一个特定退火温度的pcr仪,又叫传统的pcr仪。
用途:主要是做一些简单的、对单一退火温度的目的基因进行扩增。
(1)梯度pcr仪: 一次pcr扩增可以设置一系列不同的退火温度条件(温度梯度),通常为12种温度梯度的普通pcr仪。
用途:研究未知dna退火温度的扩增。
(2)原位pcr:将具有细胞定位能力的原位杂交技术运用于从细胞内靶dna的定位分析,在细胞内实现基因扩增的普通pcr仪。
用途:用于在细胞的靶dna所在位置上进行基因扩增。
下面的步骤是pcr的反应原理,进口pcr仪,同时也是pcr仪的工作原理。
简单的说,就是通过高温变性,退火复性,延伸三个部分。
双链dna在一定的环境中,通过在90-95℃变性,形成单链,然后退火降温到40-60℃,
在引物及其他辅助因子的作用下,定量pcr仪,使其初步结合,再快速升温至70-75℃,在相关酶的催化作用下,合成双链。完成一个扩增循环。
由此我们也可以得出pcr仪的一个主要参数:温度,温度示值是否准确,升温速率的快慢是影响其的一个主要因素。
具体要加什么缓冲液,荧光pcr仪,要加什么引物,以及其他一些辅助因子,后续我们再去了解。
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