taqman荧光探针：pcr扩增时在加入一对引物的同时加入一个特---的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；pcr扩增时，taq酶的5－3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条dna链，就有一个荧光分子形成，pcr仪，实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步。而新型taqman-mgb探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（snp），有望成为基因诊断和个体化用药分析的技术平台。
引物退火
在pcr循环过程中，控制引物退火步骤的温度是很重要的。如果温度太高，引物退火的效率会降低。太低，定量pcr仪，它的特---就会降低，这可能导致非特---产物的扩增，降低你的pcr的整体效率。
为了确定退火步骤的温度，可以建立重复的pcr反应，实时荧光定量pcr仪，每个反应使用不同的退火温度进行测试。
另外，也可以使用带有梯度块的pcr扩增仪。梯度区块允许在整个区块内同时使用一系列的温度，这意味着可以同---估多个退火温度。一些pcr扩增仪配备了分段式温度块，而不是一体式温度块，这允许同时使用范围的温度。
在pcr反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和终的平台期，因此可以在pcr反应处于指数期的某一点 上来检测pcr产物的量，并且由此来推断模板初的含量。为了便于对所检测样本进行比较，在real-time q-pcr反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值，一般这个域值（threshold）是以pcr反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号 （baseline），荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
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